摘　要：據美國農業部農業經濟研究部門最新數據統計顯示，沙門氏菌每年在美國導致的醫療花費達到37億美元，這個數據將沙門氏菌排在了美國食源性疾病花費最高的15大致病菌之首。另外，一系列沙門氏菌引起的食物中毒事件也表明，沙門氏菌早已成為全球最常見的食源性致病菌之一。傳統沙門氏菌檢測技術存在耗時、繁瑣、低效等缺點，故快速、靈敏、可靠的新型快速檢測技術成為研究熱點。將免疫學和生物化學技術有機結合，利用微生物特異性免疫磁珠和微生物測試片實現待檢致病菌的雙重篩選，大大提高了沙門氏菌檢測的特異性，靈敏度明顯高于同類產品，并大幅度縮短檢測時間。

    關鍵詞：沙門氏菌　食源性致病菌　免疫磁珠　測試片
    世界范圍內食品安全惡性事件接連發生，食品安全形勢嚴峻，衛生部統計公告的食物中毒人數逐年遞增，且食源性致病菌引起的占據首位^[1]。據WHO估計，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物所引起^[2]。沙門氏菌主要污染肉及肉制品、蛋制品、奶制品等，雞是沙門氏菌的天然宿主，感染了沙門氏菌的雞肉制品是引起人沙門氏菌感染的主要途徑。市場上的零售雞肉，沙門氏菌陽性檢出率高達50%。所以，開發快速、高效、準確的食源性致病菌快速檢測方法已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關鍵。

    1 沙門氏菌檢測方法
    國標規定，食品中沙門氏菌的檢測主要是培養法和生理生化檢測法，該檢測法的特點是方法經典，但缺點是操作繁瑣、試劑繁多、耗時較長，一個完整檢測周期需要大約5~7天時間，遠遠不能夠滿足檢測要求。目前，應用較多的快速檢測法主要是即用培養法、免疫學法、分子生物學方法等。免疫學技術的優勢是特異性高、耗時間短、結果可靠，適合批量檢測和自動化檢測；依賴于專業儀器分子學方法的優勢是靶標明確、時間短、結果可靠，明顯的不足則是引物和探針的選擇及設計不當，可能降低靈敏度和特異性^[3]；技術設備要求高，熒光探針價格昂貴，另外容易造成交叉污染是核酸法不能回避的問題等。
    因此，設計和開發出特異性好、檢測時間短、操作簡便的沙門氏菌快速檢測技術對于食品安全領域的微生物快速檢測具有重要意義。

    2 磁在快沙門氏菌測試盒原理
    免疫磁性分離技術，又稱為免疫磁珠法，可直接從樣品或前增菌培養物中分離目的細菌。磁珠上包被能夠特異識別目標細菌的抗體，通過抗原抗體反應從而形成一個磁珠和細菌的復合體，再通過磁場將磁珠收集使目標菌得到有效地富集和分離^[4]，大大縮短前增菌時間。
    微生物測試片是應用傳統的微生物培養方法和現代生化鑒定技術相結合的檢測技術。測試片的載體中含有可供目標生長的營養成分，選擇劑以及特異酶顯色底物，通過直接觀察菌落顏色即可對細菌種類做出鑒定，是一種簡單、方便、經濟的檢測方法。
    磁在快檢測試劑盒將兩種檢測方法結合，通過特異性免疫磁珠和微生物測試片對微生物進行雙重篩選，提高了沙門氏菌檢測的特異性。對于食品檢測中的復雜樣本，通過免疫磁珠的富集，能夠有效去除干擾檢測的雜質，并對樣本具有濃縮作用，靈敏度明顯高于同類產品，大幅度縮短增菌時間，整個檢測過程在24h內可完成。同時，操作簡單，不需要大型設備，可以節約空間、降低檢測成本。

    3 磁在快沙門氏菌測試盒驗證方案
    3.1 識別性和特異性
    選取沙門氏菌標準菌株及分離株按照標準方法進行培養擴增，同時計數，稀釋到測試所需濃度（100CFU/mL）。
    磁在快測試方法為：取1mL分別加入到2mL的富集管中，放置37℃，150rpm/min震蕩孵育15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測試片上，37℃，培養18h。培養結束后，計數所有測試片上顯示出藍色的菌落。
    對照方法為將1mL菌液直接涂布于LB平板中，37℃培養24h，計數所有生長菌落。
    3.2 不同菌濃度的回收效率
    選取鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）按照標準方法進行培養擴增，同時計數，梯度稀釋，每個稀釋度取1mL，按照3.1所示方法進行測定。
    3.3 不同體積的回收效率
    選取鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）按照標準方法進行培養擴增，同時計數，稀釋到100CFU/mL，100 CFU/5mL，100 CFU/10mL，100CFU/25mL，按照3.1所示方法進行測定。
    3.4 生鮮乳和豬肉中沙門氏菌的檢測方法
    生鮮乳樣品20份，采自北京某奶廠，4℃進行保藏；豬肉樣品20份，購于北京某批發市場。
    生鮮乳：取樣品25mL，加入磁珠，震蕩15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測試片上，37℃，培養18h。培養結束后，計數所有測試片上顯示出藍色的菌落。
    豬肉：取樣品25g，用20mLBPW均質，將均質液加入磁珠富集管中，37℃，震蕩4h，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻，磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測試片上，37℃，培養18h。培養結束后，計數所有測試片上顯示出藍色的菌落。
    對照方法：取樣25g，按照GB 4789.4-2010的方式進行測定。
    4 結果分析
    4.1 識別性和特異性
    通過檢測，磁在快檢測系統對沙門氏菌A、B、C、D、E不同血清型及常見沙門氏菌均可以有效富集及擴增（富集率＞75%），對干擾菌大腸桿菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌均能有效的抑制（均未生長），方法識別性和特異性良好。     4.2 不同菌濃度的回收效率
    經測定，初始菌濃度為1.3×10⁶CFU/mL，通過不同菌濃度測試，磁在快檢測系統磁珠富集容量大于5×10⁵CFU/mL，同時菌濃度處于10~10⁵CFU/mL時，菌的回收率均大于85%。     4.3 不同體積的回收效率
    結果顯示，隨著體積的增大，磁在快檢測方法的回收率略有下降，從91.6%下降為78.8%，但是回收率仍大于75%，符合測試要求。     4.4 生鮮乳和豬肉中沙門氏菌的檢測方
    檢測樣本也同時采用了國標法對樣本進行對比檢測，本實施例中的測試結果與國標法檢測結果一致。各樣本的定性檢測結果如表4所示。實驗結果顯示20例豬肉樣本中有5例檢出含有沙門氏菌，20例牛奶樣本有0例檢出含有沙門氏菌。
    經過比對，4份樣品磁在快方法和GB 4789.4-2010方法一致，1份不一致從磁在快測試片挑取菌落經鑒定為沙門氏菌。     5 結論
    通過實驗驗證，磁在快檢測方法對沙門氏菌的捕獲率均在80%以上，并有較高的特異性；免疫學結合生物化學技術快檢方法與國標法相比較，測試結果與國標法檢測結果一致，準確性無顯著性差異，靈敏度達到10個cfu以下。測試片可直接觀察菌落顏色即可對菌類做出鑒定，是一種高效、精準、操作簡單的檢測方法。免疫學結合生物化學技術快檢方法優化了食品安全檢測人員的工作方式，提高工作效率和檢測可信度，對于中國食品安全的發展具有重大意義。
    6 展望
    食源性致病菌檢測技術在不斷的發展和創新過程中，每種技術都有各自的優勢。多種技術的聯用可大大提高檢測的靈敏度，并縮短檢測時間。隨著微生物學、生物化學和分子生物學等學科的飛速發展，各種多功能微生物檢測系統的研發正逐步成為熱點。
    參考文獻：
    [1] 孫秀蘭,蔣棟磊,張銀志.生物傳感器應用于食源性致病菌檢測研究進展[J].中國微生態學雜志，2011，23(11):1040-1042.
    [2] Groundwater P W,Todd A,Worsley A J,et al. The technology andtechniques used in the detection of pathogenic bacteria[J].Pharmaceuticaljournal，2009，283(7569):281-282.
    [3] 石曉路,扈慶華,張佳峰,等.多重實時PCR 快速同時檢測沙門菌和志賀菌[J].中華流行病學雜志，2006,27(12):1053-1056.
    [4] Fitzmaurice J, Duffyb G, Kilbride B, et al. Comparison of a membrane surface adhesion recovery method with an IMS method for use in a polymerase chain reaction method to detect Escherichia coli O157:H7 in minced beef[J]. Journal of microbiological methods,2004,59:243-252.