熒光定量PCR技術檢測動物性食品中驢源性成分具有較高的準確性與穩定性，通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量。相比較于傳統的檢測方法，熒光定量PCR檢測方法具有高通量和低成本的優勢，具有廣闊的應用前景。
    在國內及國際貿易中，我國肉制品摻雜、以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴重損害了消費者的利益，并且對我國出口肉制品在國際市場上的聲譽造成損害。要杜絕這些摻雜使假的現象，關鍵手段是要建立一種能快速準確鑒別動物種源成分的檢測方法，為上述產品的質量做本質上的把關，提高執法的科學性和高效性，進一步提高檢驗檢疫通關速度。因此，建立一種快速、靈敏、特異的檢測肉類種源的檢測方法一直是有待解決的難題。
    目前，動物源性成分鑒別的主要方法有物理、化學、免疫學和分子生物學方法。
    物理學鑒別方法常用鏡檢法，通過觀察來區分禽類、哺乳動物和魚類，但該方法本身卻并不能區分動物的種類。在檢測的過程中，需要有經驗的檢驗員進行操作，可以定量檢測0.1%以下的骨片段。
    化學方法進行動物源性分析主要有色譜法和光譜法兩種，但是化學方法的樣品制備比較復雜，檢測儀器相對較貴，無法分析高度處理過的樣品。
    免疫學方法以檢測蛋白質為基礎，主要有同工酶檢測、酶聯免疫吸附分析（ELISA）以及電泳方法等，但其由于缺乏較高重現性和靈敏度以及受樣品性質影響而受到限制。免疫學鑒別方法主要用于鑒別粗加工肉類的動物種類，只有少數的方法可以用于檢測蒸煮肉類的蛋白質，因此很多的免疫學鑒別方法都不能用于熱處理肉品。
    分子生物學方法主要有常規PCR、多重PCR、實時熒光PCR等，同時DNA雜交技術、PCR-電泳、PCR-限制性片段長度多態分析技術、隨機引物的擴增法、環介導等溫擴增技術、DNA基因檢測手段式PCR技術等也是目前發展較為領先的幾種分子生物學方法。
    熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。本方法檢測原理主要利用一對動物線粒體基因保守區域特異性引物，配以FQ-Buffer、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過聚合酶鏈反應(PCR)-熒光法進行體外擴增，從而達到快速檢測的目的。
    基于熒光定量分析技術，根據常見動物如豬、驢、牛、羊的DNA序列，設計并最后確定了特異引物，建立了熒光定量PCR檢測方法，可以用于豬、驢、牛、羊肉及肉制品的種源成分快速鑒定檢測分析，具有高效、快速、準確的特點，可進行批量樣本快速檢測。方法主要用于檢測動物組織、血液以及食品、肉類制品、飼料中有動物種源性特定成份鑒定，是適用于政府檢測機構、食品加工企業、進出口貿易企業的優秀的檢測分析方法。并且檢測結果能夠達到與國家要求的行業檢測標準相一致，與歐盟、美國FDA檢測標準相符合。
    熒光定量PCR技術用于食品肉類種源檢測方法建立
    1 檢測原理
    本檢測方法用一對線粒體基因保守區域特異性引物，配以FQ-Buffer、耐熱DNA聚合酶(Taq 酶)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過聚合酶鏈反應(PCR)-熒光法進行體外擴增，從而達到快速檢測的目的，實現對動物組織、血液以及食品、肉類制品、飼料中動物源性成分的定性、定量分析。
    2 熒光定量PCR檢測方法建立
    對豬、驢、牛、羊等動物源樣品進行預處理，進而對引物和探針設計、合成及使用，經過對動物源樣品進行DNA提取與測定，構建熒光定量PCR反應體系，并在熒光定量PCR儀中進行反應，通過對反應體系、檢測手段的不斷優化，最終形成完善的熒光定量PCR檢測方法。
    3 熒光定量PCR檢測方法驗證
    以驢源檢測方法為例，進行熒光定量PCR檢測方法驗證。將動物組織經過勻漿、離心等預處理，進行DNA提取。應用熒光定量PCR快速檢測方法對動物組織中驢源成分進行檢測。取出驢-qPCR MIX、Taq酶系，配制測試反應體系。向每管中加入處理后樣品或驢-陽性質控品和陰性質控品，并將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性控品，陽性質控品以及未知標本，并設置樣品名稱和循環條件，進行梯度循環反應，并對方法的特異性、靈敏性進行驗證。反應結束后，判斷反應結果。
    檢測結果表明，本研究建立的熒光定量PCR方法具有良好的特異性，與國標方法的檢測結果符合率為100%，未出現假陽性或假陰性結果。
    用試劑盒分別檢測不同濃度驢肉組織的樣品，分別為：約1/2檢測限濃度（0.05%）樣品10個、檢測限濃度（0.1%）樣品10個和2倍高于檢測限濃度（0.2%）樣品10個測定（見表1）。
    表1 檢出限驗證結果

添加濃度（%）	0.05%	0.1%	0.2%
陽性結果	4/10	10/10	10/10

 
    檢測結果：1/2檢測限濃度（0.05%）樣品的陽性率為40%（4/10）；檢測限濃度（0.1%）樣品的陽性率為100%（10/10）；2倍檢測限濃度（0.2%）樣品的陽性率為100%（10/10）。結果表明，該試劑盒對驢源性成分的檢測限能達到的0.1%。
    利用本方法檢測陰性樣品20份，包括豬肉、羊肉、牛肉、驢肉樣本各5份，對出現陽性結果的樣本重復檢測一次，通過陰陽性來判斷試劑盒的特異性。檢測結果表明，該方法對豬肉、羊肉、牛肉、驢肉源性成分的檢測假陽率為0。
    同時，檢測含量等于或大于檢測限的豬肉、羊肉、牛肉、驢肉樣品30份，計算出假陰性率。對可疑陰性樣本重復檢測一次，統計假陰性數，計算假陰性率。按照下列公式計算假陰性率：假陰性率=假陰性數/30×100%，結果顯示該方法對豬肉、羊肉、牛肉、驢肉源性成分的檢測假陰性率為0。
    此外，通過建立20多種動物樣本的物種資源庫（包括：大鼠、小鼠、豚鼠、貓、雞、鴨、鵝、鵪鶉、牦牛、馬、狐貍、貂、貉、兔、貓、豬、羊、驢、鹿等），利用熒光定量PCR檢測方法進行物種間鑒定識別，結果顯示，本方法能夠有效識別樣本物種來源，種屬間特異性檢測結果表現良好。
    4 方法對比
通過實驗驗證可得，熒光定量PCR技術檢測動物性食品中驢源性成分具有較高的準確性與穩定性，通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量。相比較于傳統的檢測方法，熒光定量 PCR檢測方法具有高通量和低成本的優勢，具有廣闊的應用前景。
    維德維康保障食品種源安全
    北京維德維康生物技術有限公司是一家專業從事食品安全檢測、獸藥殘留快速檢測技術、動物疫病快速診斷技術研究及產品開發的高新技術企業，在獸藥、非法添加劑、毒素、細菌蛋白等化合物的抗原和抗體制備方面具有豐富的理論基礎和實踐經驗。公司堅持自主創新，現已建成了針對小分子化合物的抗體資源庫，庫容量近千種，整合自身的工藝優勢，實現了產品的高效產業化，迅速推出了當前市場緊缺的檢測產品，為食品安全檢測市場提供了更多更優的選擇。
    目前，北京維德維康生物技術有限公司已取得完備的熒光定量PCR技術成果：提取制備了相應的豬、驢、牛、羊源DNA模版，設計并合成出匹配的引物、探針，形成了完善的熒光定量PCR檢測方法，并對其特異性、穩定性、靈敏性等指標進行了檢驗，為國內肉及肉制品行業食品安全保駕護航。