各種環境樣品檢驗方法和衛生標準的制定，是衛生微生物學重要的研究內容之一。通過這些方法和標準，可以檢測并判斷水、空氣、土壤、食品、日常用品，以及各類公共場所的衛生狀況。了解這些環境條件和物品衛生狀況的目的，一方面是為預防致病性微生物通過這些媒介感染人群，引起疾病的暴發流行；另一方面為了避免不符合質量或衛生標準的食品、藥品、化妝品等流入市場，給廣大消費者造成損失或帶來危害。但從樣品中直接檢測目的病原微生物有一定難度，原因是在環境中病原微生物數量少。種類多、生物學性狀多種多樣，檢驗和鑒定方法比較復雜。有鑒于此，需要尋找某些帶有指示性的微生物，這些微生物應該在環境中存在數量較多，易于檢出，檢測方法較簡單，而且具有一定的代表性。

 

依據這些指示性微生物檢出的情況，可以判斷樣品被污染的程度，并間接指示致病微生物有無存在的可能，以及對人群是否構成潛在的威脅。指示菌的檢測為安全提供了重要保障，這已由多年來的實踐所證實。

 

當然，一個項目的衛生標準關系到物理學、化學、毒理學、微生物學等多項綜合性指標，衛生微生物學標準只是其中一部分，但它卻與人群的健康和生活質量的提高密切相關，因此是十分重要的。

 

一、指示菌的概念

 指示菌（indicator bacteria）（或稱指標菌）是在常規衛生監測中，用以指示檢品衛生狀況及安全性的指示性微生物。常規檢驗指示菌的目的，主要是以衛生指示菌在檢品存在與否以及數量的多少為依據，對照國家衛生標準，對檢品的飲用、食用或使用的安全性做出評價。

 

依據目前實際應用情況可將其分為三種類型：

第一種類型的指示菌是為了評價被檢樣品的一般衛生質量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落總數、霉菌和酵母菌數。

 

第二種類型是特指糞便污染的指示菌，主要指大腸桿菌和大腸菌群，其它還有腸球菌、亞硫酸鹽還原梭菌等。它們的檢出標志著檢品受過人、畜糞便的污染，而且有腸道病原微生物存在的可能性。

 

第三種是其它指示菌，包括某些特定環境不能檢出的菌類（如特定菌、某些致病菌、或其它指示性微生物），這些指示菌，在不同的樣品中有不同的指示意義，將在后面分別敘述。

 

二、指示菌的選擇標準

（一）一般衛生指示菌的選擇標準

  作為一般衛生質量和安全性評價的指示菌，依據不同的樣品有不同的目的要求，總的選擇原則是易于檢出，檢驗方法比較簡單、方便，有一定的代表性等。

 

（二）糞便污染指示菌的選擇標準

作為理想的糞便污染指示菌，一般認為應具備下列條件：

1．是人及溫血動物腸道正常菌群的組成部分，而且在數量上占有優勢。

 

2．在被人或動物糞便污染的樣品中易撿出，未被糞便污染的樣品中無此種菌存在。

 

3．排出體外后，在外環境中存活時間與腸道致病茵大致相似或稍長。

 

4．如作為飲用水的指示菌，對氯的抵抗力應不低于腸道致病菌或略強，而且進入水中不會再繁殖。

 

5．檢驗方法簡便，易于檢出和計數。

 

實際上，沒有任何一個菌種能完全滿足上述要求，但有少數細菌可以接近這些要求。

 

一、一般衛生狀況指示菌

（一）菌落總數

1．菌落總數的概念：菌落總數（aerobial plate count ）是指被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）、表面積（cm2）或體積（m3）內，所含有的能在某種培養基上經一定條件培養后生成的細菌菌落總數。

 

2．菌落總數的衛生學意義：菌落總數是判定檢樣被細菌污染程度的指示菌。在飲用水、水源水、食品、藥品、化妝品、物體表面、室內空氣等，以及一些進出口貿易品中，都將菌落總數的限量規定作為衛生標準之一。

 

3．菌落總數的檢驗原則：菌落總數所用培養基、培養溫度、培養時間的差異會影響到菌落計數的結果。因此，嚴格遵照國家規定的檢驗方法中的操作條件很重要，以便獲得始終可比的結果。檢測時先將固體或液體樣品作10倍系列稀釋，稀釋倍數視樣品性狀和既往檢測經驗而定。標準檢驗方法多用傾注培養法，但依據情況和需要也可選用平板表面涂布法及平板表面點滴法。

 

平板表面涂布法較傾注法的優點是，菌落生長在平板表面，便于觀察和識別，同時檢樣中的細菌不至因傾注融化的熱瓊脂時遭受損傷，從而降低菌落數；但此法使用的樣品量僅為傾注法的1／10～ l／5，使代表性受到一定影響。平板表面點滴法與涂布法相似，只是用標定好的微量滴管（每滴相當于0.025ml），將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板表面劃定的區域內，僅需培養6～8h即可計數，具有決速、節省人力、物力的優點。但因所用檢樣量少，同樣影響到代表性，故含菌量少的樣品，不宜采用此法。

 

傾注法和表面涂布法在菌落計數時都選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數計數之用。

 

應該說明的是，菌落總數的測定，一般采用平板計數瓊脂培養基，在37℃有氧條件下培養，因此不能測出每克或每毫升檢樣中實際的總活菌數。因為厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌或嗜熱菌以及有特殊營養要求的細菌，在此條件下或不能生長或不能很好地生長。因此用目前方法所獲得的結果，只能包括需氧或兼性厭氧的、嗜中溫的、能在普通平板計數瓊脂上生長的一群細菌的菌落數，它必然低于實際存在的活菌數，也不能表明污染菌的種類。

 

又由于檢品中的細菌細胞可以是單個、成對、成鏈狀，或成堆的形式存在，因此在瓊脂平板上出現的菌落不一定都是單個菌細胞形成的菌落，也可能由非單個細胞形式分裂增殖堆積而成，所以不宜報告為細菌總數，而以報告單位重量、容積、表面積或體積內菌落形成單位數（coloy forming  unit，CFU）更科學合理。

 

（二）霉菌和酵母菌數

1．霉菌和酵母菌數概念：霉菌和酵母菌數是指檢樣經過處理，在一定條件下培養后，所得1g或1ml檢樣中所含的霉菌和酵母菌菌落數。

 

2．霉菌和酵母菌數的衛生學意義：由于霉菌和酵母菌營養要求較低，存活力強，在pH值、濕度、溫度偏低；含鹽、含糖量高；以及含抗生素的環境中均可生長?？梢栽斐墒称?、藥品或其它日常用品發霉變質，散發出難聞的氣味，有些霉菌還可以產生毒素，從而使產品失去食用或使用價值，甚至造成真菌毒素中毒癥。因此一些樣品將霉菌和酵母菌也作為評價衛生質量的指標菌，并以霉菌和酵母菌數作為判斷檢樣被霉菌和酵母菌污染程度的標志，同時制定了相關檢品的霉菌和酵母菌數限量標準。

 

3．檢驗原則：霉菌和酵母菌計數常用的培養基，我國多采用高滲察氏培養基、加有抗生素的馬鈴薯一葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅（虎紅）培養基。菌落計數應選取菌落數在15～150之間的平板作為霉菌和酵母菌數測定計數之用。目前我國在糕點類和奶油類食品、藥品、化妝品等檢樣中都規定了霉菌和酵母菌的檢出限量標準。

 

二、糞便污染指示菌

（一）大腸桿菌和大腸菌群

1885年Escherich分離出大腸桿菌，并認為是人和溫血動物腸道中正常菌群的重要組成部分，為其后以該菌作為環境被糞便污染的指示菌奠定了基礎。1892年Schardinger首先提出以大腸桿菌作為水源中病原菌指示菌的建議。1893年Theobald Smith指出，大腸桿菌因普遍存在于人和動物的腸道內，所以若在腸道外的環境中發現，就可以認為是被人和動物的糞便所污染。從此便開始應用大腸桿菌作為水源被糞便污染的指示菌。1937年Jordan H．E．提議在衛生細菌學上用“大腸菌群”代替“大腸桿菌”，這一建議受到了各國學者的重視，便逐步以“大腸菌群”代替了“大腸桿菌”作為水質和食品被糞便污染的指示菌。目前，世界各國仍采用“大腸菌群”作為糞便污染的指示菌。

 

1． 大腸桿菌

大腸桿菌以具有β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶為其特征。多數菌種可以在44℃～45℃培養條件下生長。具有發酵乳糖產酸產氣，分解色氨酸產生吲哚等生化特點。

大腸桿菌在人及動物糞便中大量存在，新鮮糞便中可達每克109，因此大腸桿菌若在環境樣品中檢出，可以認為該樣品受到了人或動物糞便的污染或用以判斷水質消毒處理上的效果不佳。

 

大腸桿菌雖是較理想的糞便污染指示菌，但是由于它的鑒定方法比較復雜，有些快速檢驗法，也尚未作為標準方法應用，所以，直接用其作為糞便污染指示茵的樣品不多。我國在藥品衛生細菌學檢驗中，口服藥類規定不得檢出大腸桿菌。

 

2．大腸菌群（總大腸菌群）

大腸菌群或稱總大腸菌群是指一群能在35℃～37℃條件下24～48h內發酵乳糖產酸產氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群不是細菌分類學上的一個名稱，而是人為議定的名詞。符合這些條件的腸桿菌科細菌主要包括4個菌屬：埃希氏菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關的僅有一個種，即大腸桿菌；其次有檸檬酸桿菌屬，其代表種有弗勞地拘檬酸桿菌；克雷伯氏菌屬，代表種為肺炎克雷伯氏菌；腸桿菌屬，代表種有陰溝桿菌和產氣桿菌。

 

3.耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）

耐熱大腸菌群或糞大腸菌群即能在44℃～45℃發酵乳糖的大腸菌群。耐熱大腸菌群的主要組成菌屬與總大腸菌群相同，也包括上述4個菌屬，但主要組成是埃希氏菌屬；克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬及腸桿菌屬所占數量較少，因為其部分菌種（尤其是來自環境的菌種）不適于在44℃～45℃溫度下生長。

 

（二）腸球菌

 

腸球菌的生物學特性：腸球菌是人及動物腸道中正常菌群，自然界分布廣泛，常存在于水、土壤、空氣中。在人糞中所占數量少于大腸桿菌，每克糞便約含108，在動物糞便中所占數量較高。

 

（三）亞硫酸鹽還原梭菌

亞硫酸鹽還原梭菌 的代表種是產氣莢膜梭菌，是人和動物特別是食草動物腸道內的常住菌，數量少于大腸桿菌，每克糞便約為105～106，在自然界有廣泛分布，主要在土壤中；污水、糞肥、空氣或塵埃中也有其存在?？杀蛔鳛榧S便污染的指示菌。這類細菌的特點是厭氧生長、能形成芽胞、能還原亞硫酸鹽為硫化物。對含氯消毒劑及外界不良環境有較強的抵抗力，在外環境中存活時間較長。所以若檢樣中產氣莢膜梭菌被大量檢出而大腸菌群數很少時，則表示檢品曾受過糞便污染，但不是新近的污染，而表示有陳舊性污染。故可以與大腸菌群互補監測。常被作為水或土壤衛生細菌學檢驗中的指標菌。有些國家在食品中也規定了該菌檢出的限量標準。

 

三、其他指示菌

（一）特定菌與不得檢出的致病菌

1．概念特定菌：是指在某些檢品中規定不得檢出的菌類，規定的原則是從這些檢品的使用安全性出發，依據國內情況，參考國際標準而制定的。其中包括非致病菌（或條件致病菌），以及致病菌。例如藥品、化妝品都規定了特定菌檢驗的限制范圍，而且根據給藥途徑不同，對不同的藥品都做了具體規定。

 

2． 常用的致病菌指標菌

（1）金黃色葡萄球菌；

（2）銅綠假單胞菌通稱綠膿桿菌；

（3）沙門氏菌；

（4）志賀氏菌；

（5）鏈球菌。

 

（二）特殊環境的衛生指標菌

除水、空氣、土壤、食品等為了了解其衛生狀況和安全性制定了指示菌及其限量標準外，還有一些領域也需要使用指示菌，在消毒滅菌效果的監測中指示菌的應用尤為重要。如判斷壓力蒸氣滅菌效果，常以嗜熱脂肪桿菌芽胞為指示菌；判斷電離輻射滅菌或消毒效果，常選用抗輻射性強的短小芽胞桿菌為指示菌；判斷環氧乙烷滅菌或消毒效果，以枯草桿菌黑色變種芽胞為指示菌。通過檢驗上述指示菌的存活情況，來判斷滅菌或消毒效果及被消毒物品的使用安全性。

 

（三）腸道病毒的指示微生物

由于大腸菌群對氯等飲水消毒劑的耐受力較某些病毒（如柯薩奇病毒、肝炎病毒）弱，因此認為大腸菌群不是水中病毒適宜的指示菌。存在于水中的病毒型別很多，不可能逐一檢查，為便于水中病毒污染或消毒的研究工作，很多學者進行了關于選擇水中病毒指示微生物的工作，理想的條件是：①檢驗方法簡單；②操作安全；③在被人糞腸道病毒污染的環境中一定存在，其存在數量應等于或大于腸道病毒的數目；④對于消毒劑和外環境的抵抗力應與腸道病毒一致或稍強。報告較多的是對脊髓灰質炎病毒和大腸桿菌噬菌體的研究。

 

一、樣品的采集與送檢

（一）樣品的采集

 衛生微生物檢驗的目的是對水、食品、室內空氣及其它物品作出衛生學評價，涉及的對象主要是物品和生活環境。為保障人群的安全及執行衛生法的嚴肅性，檢查結果應準確客觀。樣品的采集、保存和運送是否恰當，直接關系到檢驗結果，是做好檢驗工作的前提。

對不同的樣品有不同的具體采樣要求，原則上需注意以下幾方面的問題：

1．采集的樣品必須有代表性，采樣量、采樣部位應依檢樣歸屬類別的標準要求執行，注意采用隨機抽樣法，并按批號抽樣。

2．由于檢測的是樣品實際污染狀況，因此應嚴格避免由于采樣對檢品造成新的污染。所有采樣用具、容器需嚴格滅菌，并以無菌操作采樣。

3．固體粉末樣品，應邊取邊混合；液體樣品應振蕩混勻；涂擦取樣的棉拭子在揩后剪斷，投人稀釋液充分振搖，作為原液。

4．注意對樣品的詳細標記，以防錯亂。

 

（二）樣品的送檢與保存

1、為避免樣品變質和樣品中微生物的增殖或死亡，原則上送檢時間越快越好。

2、不能及時送檢或檢驗的樣品，如系食品和水樣一般要求在低溫條件下保存；藥品和化妝品僅要求放在室溫陰涼干燥處，不必冷藏或冷凍，以防引起產品質量的變化。

3、樣品在檢驗前應保持原包裝狀態，嚴禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。液體樣品要保證包裝完好，防止運輸中外溢或散漏。

 

二、樣品的檢驗與報告

（一）樣品的檢驗原則

1．檢驗樣品用量按各類樣品標準要求執行。

2．檢驗過程中，所用器材、材料應事先滅菌備用，檢驗應在無菌室或生物安全柜內進行，防止微生物的再污染或擴散。

3．如果一個樣品需做多種分析，如微生物、化學、毒理等，宜先取出部分樣品做微生物檢驗，其余部分留做其它檢驗用。

4．供試品為固體、非水溶性軟膏等，注意需均質化后再行稀釋，供試品制備成供試液后，應在均勻狀態取樣。

5．凡有防腐劑、抗生素、消毒劑或其它抑菌物質的檢品，檢驗時應對其抑菌作用予以去除，可采取中和法、濾膜過濾法、稀釋法等。還應考慮到采取適當步驟，使受環境或消毒劑損傷的菌株得以復蘇，如采用較低溫度下的預培養等，以提高檢出率。

6．做到檢驗方法和實驗室操作程序的標準化，以保證實驗結果的可靠性與可比性。

 

（二）結果報告

1．細菌、霉菌、酵母菌菌落總數的測定，一般樣品以1g或lml為單位的菌落數表示；表面涂擦采樣或空氣采樣以  1cm2或1m3為單位的菌落數表示，例：CFU/g（ml）或CFU/cm2（m3）。

2．特定菌或致病菌檢驗報告，一般以1g或1ml為單位報告“檢出”或“未檢出”。

3．最近似數（MPN）的報告：最近似數或譯為最可能數。當樣品中準備檢測的某種細菌數極低（如低于每g含10個菌），且又混雜在其它細菌之中的時候，無法采用平板菌落計數的方法進行計數，在這種情況下MPN法在計算菌數，特別是極少的菌數時很有用處。最常用的是水和食品中大腸菌群的計數，其它還有用于糞大腸菌群、沙門氏菌、葡萄球菌、產氣莢膜梭菌等的計數。