劉勝桃，宋 鴿，王秀艷，李慧娟，常建軍，王 宏

(蒙牛乳業(沈陽)有限責任公司，遼寧沈陽 110122)

摘 要：目的：研究一種可行、適用、準確的霉菌檢測培養方法，來解決培養過程中培養基干裂、環境污染、菌落計數不準確的問題。方法：對膜包裹法、培養盒法、直接培養法3種方法進行比較，來評價3種方法的可行性、適用性和準確性。結果：采用直接培養法培養的空白和樣品出現較大程度的污染及干裂現象，膜包裹法、培養盒法培養的樣品未造成污染，培養基未干裂不影響菌落計數。結論：采用隔離的方法能夠有效控制培養基干裂和污染的問題，提高菌落計數的準確性，同時可避免霉菌孢子在培養、觀察過程中擴散到環境中，造成污染，培養盒法較膜包裹法更方便、快捷、易觀察，是實驗室值得推廣的培養方法。

關鍵詞：霉菌;污染;干裂;隔離;培養

霉菌是絲狀真菌的統稱，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染[4]。霉菌可引起食品、農產品的發霉變質，霉菌毒素可導致慢性中毒具有致癌、致畸、致突變作用[5]，可對人體健康造成危害[6-12]。霉菌的監測也成為食品檢驗技術與食品衛生質量評價中的重要組成部分[13-16]，我國先后5次修訂了食品中霉菌計數的方法標準[17-21]，據此我國各級監督檢測機構全面開展食品中霉菌的檢測工作，自《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數》(GB 4789.15—2016)實施以來將原標準中倒置平板培養改成正置平板培養，霉菌培養中的污染和培養基干裂現象頻發，這主要是因為霉菌菌落可產生數量巨大的孢子，同時霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長和抗逆性強等特點，任何一個孢子在適宜條件下都能發展成新的個體。常規霉菌檢測的培養過程中，以及觀察移動過程中，不可避免地造成空氣流動，霉菌孢子可趁機飄散進入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴重的交叉污染和外部侵染[22]。又因霉菌的培養時間較長，培養基在培養過程中水分損失較大，即使加大了培養基的傾注量，也無法避免培養基干裂，從而導致影響菌落計數的問題，而目前這兩項常見且棘手的問題始終困擾著相關人員，且無有效的控制

措施。

本實驗室在日常霉菌檢測中采取兩種隔離培養方法，即膜包裹法、培養盒法，對霉菌孢子擴散、污染及培養基干裂的控制效果顯著，且成本低廉，操作簡便，對比《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》(GB 4789.15—2016)(以下簡稱國標法)的計數結果，探討霉菌檢測過程中隔離式培養方法的可行性、實用性和準確性[23-27]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1　樣品來源

霉菌和酵母質控樣(QC-FD-020)，來自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心;霉菌和酵母質控樣(A062018M)，來自北京美正檢測技術有限公司。

1.1.2　試劑

孟加拉紅瓊脂，CM164，北京陸橋技術服務有限公司。

1.1.3　耗材

霉菌培養盒，食品級PVC材質，分為4個凹槽，凹槽與培養皿直徑及高度相匹配，每個凹槽有3個透氣孔，培養過程中形成有氧培養環境，此裝置為一次性使用，計數后的培養皿連同裝置一同高壓滅菌處理即可;保鮮膜或封口膜。

1.2　儀器與設備

BSC-1300IIB2生物安全柜(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);SSW-600-2S恒溫水箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);MJX-250BⅢ霉菌培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司);MSⅢ basic漩渦混合器(德國IKA)。

1.3　實驗方法

1.3.1　膜包裹培養法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養基，待瓊脂凝固后，在潔凈室中將平皿4～6個疊放，外層包裹保鮮膜或封口膜，在疊放的皿與皿之間用刀劃上長約2 cm的透氣孔，每層劃2～3個透氣孔，正置平板，置(28±1)℃培養箱中培養，同時以直接培養法的樣品作為對照，觀察并記錄培養至第5 d的結果。

1.3.2　霉菌盒培養法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養基，待瓊脂凝固后將平皿正置于霉菌盒中，每個槽可放置一個培養皿，將上蓋蓋嚴即可放入(28±1)℃培養箱培養，同時以直接培養法的樣品做對照，觀察并記錄培養至第5 d的結果。

1.3.3　直接培養法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養基，待瓊脂凝固后，正置平板，置(28±1)℃培養箱中培養，同時以直接培養法的樣品作對照，觀察并記錄培養至第5 d的結果。

2　結果與分析

2.1　膜包裹培養法、霉菌盒培養法與直接培養法結果比較

對8組不同類型的樣品(已知不含菌樣品)進行霉菌檢測，同時監控5組空白實驗，每組樣品每個稀釋度均進行兩組平行檢測，用膜包裹培養法和霉菌盒裝置培養的8組實驗樣品及5組空白對照，均未出現污染、培養基干裂的情況，同時使用菌片法進行檢驗驗證結果一致。而采用直接法培養的13組樣品，10組樣品出現不同程度的污染，部分培養基干裂，樣品污染情況占比69%，培養基干裂數量占比77%。

實驗結果表明，膜包裹培養法和霉菌盒裝置培養法均可將環境中的污染來源完全隔離，且可以保證在較長的培養時間內降低培養基水分的損失。但霉菌盒裝置在結果觀察過程無需打開培養盒，可直接透過培養盒清晰地對菌落進行觀察計數，達到從樣品培養到出具結果，最終到廢棄物處理環節，培養物與外界環境始終保證有效的隔離，避免了環境、樣品、人員相互污染的風險。膜包裹培養法、霉菌盒正置培養法與直接法培養結果如表1所示。

2.2　膜包裹培養法、霉菌盒培養法準確性測試

使用膜包裹培養法及霉菌盒培養法對6組不同特性區間及不同廠家的霉菌質控樣品進行檢測，每組樣品、每個稀釋度均進行兩組平行檢測，檢測結果均在質控樣品特性區間，將膜包裹培養法得到的結果與霉菌盒培養法得到的結果配對檢驗，p=0.18>0.05，表明無顯著性差異;培養過程中未出現培養基干裂及污染的現象，空白對照均無菌落生長，證明了兩種隔離培養方式不會對霉菌的生長產生影響，如表2所示。

3　結論與討論

本研究通過對膜包裹法、霉菌盒培養法、直接培養法培養過程進行比較，發現膜包裹法、霉菌盒培養法可有效解決在培養過程中水分流失造成的培養基干裂問題，且無污染，同時對質控樣品檢測發現上述兩種隔離培養方式不影響菌落計數，不影響霉菌的生長。因膜包裹法觀察過程中需要將膜拆開，而霉菌盒培養法較膜包裹法的優勢在于在觀察和計數過程中不需要打開霉菌盒裝置，透過裝置可清晰對菌落進行觀察計數，從平板培養到最終廢棄物處置，培養物與外界環境始終保證有效的隔離措施，避免了環境、樣品、人員相互污染的風險。操作方便、成本低廉，霉菌培養盒也可應用于培養時間較長和(或)溫度較高的微生物檢測項目，例如嗜熱需氧芽孢檢測等，是實驗室值得推廣的培養方法。

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