對市郊家養奶牛的鮮牛乳及自制酸乳和冰淇淋中金黃色葡萄球菌含量的檢測與評估

□ 靳志敏 王燕 王茹 鄭玉山 張宏博(通訊作者) 內蒙古自治區食品檢驗檢測中心

摘　要：本文通過對內蒙古自治區呼和浩特市郊區普通農戶的家養獨立奶牛所產生鮮牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌的含量進行檢測，判斷其制品的質量是否合格。檢測結果顯示，呼和浩特市郊區普通農戶的獨立奶牛所產生鮮牛乳及自制酸乳、冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌數量為0cfu/g，品質合格。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌 革蘭氏染色實驗 血漿凝固酶實驗

1 引言

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起人類細菌性食物中毒及奶牛乳房炎癥的重要細菌之一[1]。在顯微鏡下,金黃色葡萄球菌呈球狀，直徑約0.8μm，其細胞既沒有芽孢也沒有鞭毛，但少部分會有莢膜;在平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1~2mm。金黃色葡萄球菌的生長條件簡單，可在沒有水的條件下存活幾周，屬于需氧或兼性厭氧微生物，其在普通培養基上就可以生長，最適宜生長的pH值為7.4;最適生長溫度為37℃，溫度過高會使金黃色葡萄球菌死亡[2]。

金黃色葡萄球菌容易引發大規模食物中毒，在造成經濟損失的同時產生嚴重的社會影響[3]。在乳及乳制品中，可能由于奶?；加腥榉垦装Y等原因而易發生金黃色葡萄球菌污染現象。所以本實驗對內蒙古自治區呼和浩特市郊區普通農戶的家養獨立奶牛所產生鮮牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌的含量進行檢測，判斷其制品的質量是否合格。

2 材料與方法

2.1 樣品

樣品包括現擠生鮮牛乳(散裝)、自制酸乳、自制冰淇淋3類，均來自內蒙古自治區呼和浩特周邊旗縣村散養養殖戶家中，共計20戶，地區分布如圖1。樣品冷凍或冷藏保存，且在8小時內送達實驗室進行檢驗。

圖1  呼市地區周邊旗縣采樣分布圖

實驗選擇樣品作為實驗組，將1mL金黃色葡萄球菌原液加入到25mL無菌水作為陽性對照組，無菌水為陰性對照組。

2.2 實驗方法

2.2.1 檢測方法

參考《國標食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌》GB 4789.10-2016對樣品進行金黃色葡萄球菌檢測。牛乳、自制酸奶各取25mL，冰淇淋雪糕則用電子天平取25g，將樣品放入裝有225mL 0.85%的氯化鈉溶液均質袋中，均質1分鐘后得到1:10的均勻樣液。用移液器吸取制好的均勻樣液1mL，加入至9mL氯化鈉溶液的鹽水管中，充分震蕩，或用移液槍反復吸取，使其充分混勻后制成-2級樣品勻液;重復上述步驟，將樣品稀釋到-4、-5、-6、-7級(每次吸取完上一級樣品勻液后需更換移液器的槍頭以防止梯度不準)。將稀釋好的每一個梯度樣品勻液吸取1mL，加入到接種量分別為0.3mL、0.3mL和0.4mL的B-P(Baird-Parker)平板中，加入后用無菌涂布棒涂布整個B-P板，涂布過程需防止將培養基刮破，注意不要碰到培養基邊緣[4]。涂布過程中B-P板最好有一定余溫，這樣可以使樣液被平板更好吸收。當B-P平板表面沒有明顯樣液時，涂布完成;將平板靜置10分鐘后，倒置于36℃恒溫培養箱中培養48h，然后取出觀察是否有菌落生長。若有數據，需保存好數據并準備滅菌殺毒;若沒有，可直接放入生物垃圾袋等待滅菌殺毒。

2.2.2 驗證方法

在觀察過程中若有典型的金黃色葡萄球菌落生成則要進行驗證實驗。

①革蘭氏染色實驗：利用已經制好的結晶紫溶液、革蘭氏碘液以及沙黃對在B-P板上長出的典型菌落進行染色。首先將典型的菌落制成涂片放到顯微鏡上，滴幾滴結晶紫溶液，一分鐘后用水洗掉;然后滴加革蘭氏碘液，讓其在涂片上停留作用一分鐘后水洗[5];接著用乙醇進行褪色處理，一般30秒即可，直到完全洗掉，但不能太過脫色，之后用水清洗;最后，滴加上沙黃復染液，約一分鐘后水洗，晾干后進行鏡檢[6]。

②血漿凝固酶實驗：將每個長菌B-P平板上典型的金黃色葡萄球菌菌落都接到BHI與營養瓊脂的小斜面試管中，在37℃下培養18h。將凍干兔血漿加水溶解后，向瓶中加入0.3mL培養過的BHI(腦心浸出液肉湯)，充分震蕩，放在36℃下培養，每隔半個小時觀察一次，并持續觀察6個小時，如果有凝固或者凝固的體積比原來的體積大一半，則可以判斷為陽性的結果，菌落為金黃色葡萄球菌[7]。

若對結果還存有疑慮，可挑選經過小斜面培養的金黃色葡萄球菌菌落于BHI中，在37℃下培養18h，再次重復上述過程。

3 結果與分析

3.1 檢測結果

實驗組中生鮮牛乳在36℃下培養48小時后，結果如表1所示(因為樣品實驗后結果完全相同，故只取其中5組數據舉例分析，下同)，菌落數量為0cfu/g，且由圖2可以看出B-P板上未出現金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測的樣品均品質合格。

實驗組中，自制酸奶在36℃下培養48小時后，結果如表2所示，菌落數量為0cfu/g，且由圖3可以看出B-P板上未出現金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測的樣品均品質合格。

實驗組中，冰淇淋雪糕于36℃下培養48小時后，結果如表3所示，菌落數量為0cfu/g，且由圖4可以看出B-P板上未出現金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測樣品的品質均合格。

陽性對照組實驗中，B-P板上有菌落生長如圖5所示，結果如表4。經計算，金黃色葡萄球菌數量為4.9×108cfu/g。

陰性對照組中，由圖6可以看出B-P平板沒有金黃色葡萄球菌菌落生成，結果如表5，證明實驗沒有被污染，實驗成功。

3.2驗證結果

對陽性對照組B-P板上的菌落進行革蘭氏染色實驗，染色實驗現象如圖7所示，排列呈葡萄球狀、無芽胞、無莢膜、直徑約為0.5~1μm。驗證該微生物為金黃色葡萄球菌，驗證成功。

將B-P板上生長出的黑色小點沾取一點，然后在營養瓊脂小斜面輕輕上劃線，培養后均如圖8所示，圖中透明無色的部分為生長出的菌落，驗證成功，黑色小點是一種微生物菌落。

將B-P板上長出的菌加入到BHI培養液做血漿凝固酶實驗，本次血漿凝固酶實驗均用凍干兔血漿，加500mL無菌水溶解后加入0.3mL的BHI培養液，血漿凝固酶實驗結果如圖9所示，圖中左側為金黃色葡萄球菌陽性菌，右側為陰性對照實驗，左側瓶中出現凝固，結果為陽性，表明該微生物為金黃色葡萄球菌。

4 結論

本實驗對呼和浩特市郊區普通農戶的家養獨立奶牛所產生鮮牛乳以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌進行檢測，結果顯示，3種自制產品中金黃色葡萄球菌的菌落數為0cfu/g，表明產品中均不含有金黃色葡萄球菌，品質合格。

本次實驗對呼和浩特市市郊20戶散養養殖戶的生鮮牛乳及乳制品的檢測中未發現金黃色葡萄球菌，說明呼市散養養殖戶家生產的生鮮牛乳及乳制品符合食品安全規范。但是由于樣本量較少，仍不足以說明全部地區都符合安全標準。對于金黃色葡萄球菌的檢測是必不可少的，企業和監管部門一定要足夠重視食品安全，并時刻關注金黃色葡萄球菌的檢測發展。

參考文獻：

[1] 陳丙卿，王茂起.現代食品衛生學[M].北京:人民衛生出版社，2001，757-758.

[2] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社，2001，246-247.

[3] Post. D.E Food pathogens(Staphylococcus aureus)[J].Monograph number 6. England.

[4] 張穎.金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進展[J].中國動物保健，2014，(6):17-19.

[5] 謝范英.食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法比較研究[J].現代商貿工業，2014，(17):197-198.

[6] 黃嶺芳，賴衛華，張莉莉.食品中金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進展[J].食品與機械，2009，(6):181-185.

[7] GB 4789.10-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗[S].