甲醛由于具有強烈的致癌和致畸性，中國食品安全法明確規定禁止在食品中加入甲醛。但是，由于甲醛具有防腐、漂白作用，一些不法分子為了利潤依然違法添加，導致食品安全事件不斷發生，因此，對食品中甲醛含量進行檢測對于維護人民的健康有重要的意義[1]。由于甲醛紫外吸收非常的弱，通過衍生化反應引入有強紫外吸收的基團，這些衍生物可被液相紫外檢測器檢測。本文利用2,4-二硝基苯肼對甲醛衍生化，然后利用高效液相色譜測定面粉中甲醛的含量。

　　材料與方法,市售面粉，甲醇，乙腈，2,4-二硝基苯肼均為分析純(AR)，購于天津市永大化學試劑有限公司;甲醛為標準品，購于環境保護部標準樣品研究所。

　　1.2 實驗原理
 

　　在酸催化的作用下，2,4-二硝基苯肼與甲醛反應生成紅色的2,4-二硝基苯腙，然后在紫外的檢測下，經過流動相的洗脫，在柱子上會有保留，從而間接測定甲醛的含量[2]。

　　實驗步驟 基本色譜條件

　　色譜柱：Eclipase-XDB C18(4.6mm*250mm，5μm安捷倫科技有限公司)柱溫箱溫度：25℃;流動相：乙腈/水=60/40 (V/V);檢測波長：350nm;流速=1ml/min;進樣量為10μL。

　　1.3.2 甲醛衍生化初始條件,取一定量的甲醛標準液或者樣品溶液，加入2,4-二硝基苯肼(與甲醛的摩爾比為1:1)，加入1ml 0.5mol/L的pH=5的醋酸鈉-醋酸緩沖液，混勻50℃反應30min，取樣采用HPLC進行分析。樣品測定,精確稱量市售面粉0.5g左右，精確到0.001g，然后加水稀釋到50ml的容量瓶中，然后放置于超聲波中超聲30min，并精確取出 5ml，然后加入已經配好的1ml 2,4-二硝基苯肼溶液，1ml pH=5的醋酸鈉-醋酸緩沖液，并加入甲醇定容到10ml的容量瓶中，搖勻，恒溫60℃水浴中保持30 min，然后取出用5000r/min離心2min，經微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。

　　結果與討論

　　衍生化初始pH的考察，2,4-二硝基苯肼與甲醛的親核加成反應要在酸性條件下才能進行，酸度的大小會對反應能否進行到底有重要的影響。在pH介于2-5之間時，隨著pH的升高，甲醛衍生的產物的峰面積增加，也就是pH的升高有助于甲醛衍生化產物的形成。當pH為6時，產物的峰面積反而降低。pH越低，解離出來的質子就越多，過多的質子會和2,4-二硝基苯肼上的氨基形成鹽，會抑制反應的進行。當pH過高，解離出來的質子就越少，羰基就不容易被質子化，反應也不容易進行[3]。因此，選擇pH=5作為衍生化最佳的pH。衍生化初始溫度的考察,在反應體系初始pH=5的基礎上，考察了不同溫度對衍生化的影響。在30℃-60℃之間，隨著溫度的升高，峰面積也在增加，說明溫度升高有利于產物的生成。但是當溫度=70℃時，產物的峰面積反而下降，這可能是溫度過高，甲醛揮發，反應液中甲醛的量偏低，而反應到產物峰面積的減少[3]。因此，確定最佳的溫度為60℃。衍生化時間的考察,在初始pH=5，溫度=60℃的基礎上考察了衍生化時間對衍生化影響。在前30min，隨著時間的延長，衍生化產物的峰面積一直在增加。當大于30 min后，產物的峰面積就不在增加，說明已經反應完全。選定30min為后續的衍生化時間。

　　在確定甲醛衍生化的pH為5，溫度為60℃，反應時間為30min的基礎上，考察了不同的衍生化試劑(2,4-二硝基苯肼)與甲醛的摩爾比對產物峰面積的影響。當2,4-二硝基苯肼與甲醛的摩爾比值為1時，甲醛并沒有反應完全，當2,4-二硝基苯肼的量增加到1.2倍時，產物的峰面積達到最大值。2,4-二硝基苯肼得量繼續增加，產物的峰面積也不在增加。也就是說2,4-二硝基苯肼的用量為甲醛的1.2倍時為最佳。

表1 所采用方法的精確度
 

　　從表1可以看出，在所稱量的0.5g樣品中平行5次實驗中其平均值為3.35(mg/kg)，RSD為4.41%，說明該方法的精確度非常的高。

　　所采用方法的回收率

　　向市售面粉中加入不同濃度的甲醛標準溶液，并采用上述衍生化并采用高效液相色譜的操作步驟進行。在原有市售面粉中甲醛含量為3.35 mg/kg的基礎上依次加入3ml、6ml、9ml、12ml濃度為1.2μg/ml的甲醛溶液。

表2 方法的加標回收率
 

　　從表2中可以看出，樣品的回收率在97.1%-102.1%之間，說明樣品的回收率也非常的高，也說明了該方法的可行性。

　　2,4-二硝基苯肼衍生化甲醛的最佳條件pH=5，溫度=60℃，時間為30min，2,4-二硝基苯肼的用量為甲醛的1.2倍時，該方法的RSD為4.41%，樣品的回收率在97.1%-102.1%之間。方法的準確度和精確度都很具有很強的實際應用價值。