高效液相色譜法的特點。流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓；分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內即可完成，一般小于1小時；分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍；紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級；百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。用一根柱子可分離不同化合物；樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

米粉中次硫酸氫鈉甲醛的檢測

檢測儀器主要有：Agilent1100高效液相色譜儀;HY-5回旋式振蕩器;800電動離心機;雙功能水浴恒溫振蕩器。所需試劑主要有：甲醛標準溶液由36%～38%甲醛配制成40μg/mL標準儲備液,經硫代硫酸鈉標定濃度后,置于4℃冰箱中保存一個月,使用時臨時稀釋成所需濃度;2,4-二硝基苯肼經純化后稱取0.2g,加乙腈溶解定容至100mL,配制成2g/的衍生試劑,置于棕色瓶中;磷酸氫二鈉稱取18g加水溶解定容至100mL。正己烷、鹽酸、氯化鈉等以及二次蒸餾水。樣品提取取適量米粉（10g），粉碎后加入100mLHCl—NaCl溶液震蕩提取40min。將提取液轉移到離心管中于4000r/min離心30min，上清液備用。衍生化 取2mL樣品提取液至25mL比色管中，并加入1mL磷酸氫二鈉溶液、0.5mLDNPH衍生試劑，均勻混合后定容至10mL,60℃水浴衍生20min。標準溶液與樣品同時進行衍生。衍生產物2,4-二硝基苯腙用正己烷萃取2次,每次5mL,合并萃取液濃縮至5mL，上機測試。標準曲線 分別取2μg/mL的甲醛使用液0.00、0.25、0.5、1、2、4mL于25mL具塞比色管中,加2mLHCl-NaCl溶液、1mL磷酸氫二鈉溶液、0.5mLDNPH衍生試劑,混合均勻,定容至10mL,60℃水浴衍生20min。正己烷萃取后取10μL進樣。根據保留時間定性,峰面積定量,每個濃度重復做兩次,取平均值,以峰面積與甲醛濃度,繪制標準曲線。取樣品萃取液10μL注入HPLC測得積分面積后從標準曲線查出相應的濃度,計算甲醛含量。HPLC上機測定 AgilentHPLC1100帶紫外檢測器(DAD);色譜柱:ZORBAX SB C18,150mm×4.6mm×5μm;流動相:乙腈∶水=60∶40(v/v);流速:0.8mL/min;檢測波長:355nm;柱溫:25℃;進樣量:10μL;運行時間:7min。

由于所采集的米粉樣品中未檢出有甲醛次硫酸氫鈉，因此在樣品中加入甲醛次硫酸氫鈉標準品，米線樣品加標的離子色譜圖如下圖所示。根據色譜圖可知，樣品中的其它雜質對甲醛次硫酸氫鈉無影響，甲醛次硫酸氫鈉的分離度較好。采用的淋洗方式為梯度淋洗，在13min后基線有向上飄的趨勢，但不影響甲醛次硫酸氫鈉的定性、定量，甲醛次硫酸氫鈉出峰的位置(5min左右)基線較平穩。

高效液相色譜法測定米粉中次硫酸氫鈉甲醛吸收色譜圖

測定條件選擇 改變流動相配比可以進一步改變雜質峰與甲醛衍生物的分離度,在實驗中可以發現發現乙腈水為60∶40,流速為0.8mL/min,分離效果最好。通過最大吸收波長掃描驗證了波長在355nm處吸收峰最大,檢測波長選為355nm。

線性范圍與線性方程 通過上述實驗步驟得到如下圖的以甲醛含量(μg)為橫坐標，甲醛衍生物苯腙的峰面積為縱坐標的標準工作曲線。線性方程y=73.4054x+11.2965，相關系數0.9996，在0.5～8μg范圍內線性關系良好，最低檢測濃度為1μg(S/N=3)，以取樣量10g計，本法對樣品的檢出限為0.1μg/g。通常甲醛或吊白塊作為食品添加劑在食品中的加入量遠高于10mg/kg才有防腐的效果,故此方法檢出限完全滿足食品分析的要求。

高效液相色譜測定甲醛標準曲線

衍生條件優化 甲醛與2，4—二硝基苯肼的衍生反應速度較慢，衍生時間對測定結果影響很大。固定其他條件如水浴溫度60℃，衍生試劑用量為2g/L,考察了衍生時間從15、20、30、40、60min對測定結果的影響。結果表明，甲醛衍生物的峰面積隨著衍生時間的增加而增大,20min后趨于穩定，實驗選擇衍生時間為20min。甲醛與2，4—二硝基苯肼反應生成黃色的2，4—二硝基苯腙，先后用5mL正己烷萃取，即可將萃取層萃取近無色,將衍生產物幾乎萃取完全。

質量標準中的系統適用性試驗，最好能將最難分離的雜質訂入系統適用性試驗用溶液的配制，將此雜質的濃度配制為主成分濃度的1%、0.5%、0.2%進行試驗，驗證分離度后，再進行樣品的測定，以確保試驗的準確進行。質量標準中，應配制系列濃度的對照溶液，以對雜質有“半定量”的概念，這可更好地評價雜質存在的情況；并應規定雜質的個數及最大雜質斑點的限度，使質量標準更完善、科學。錯誤的一種誤區，認為HPLC法完全替代了TLC法，這是不正確的，一定要做到相互補充、相互論證、相互參考才是最客觀、最科學的。

徐體華 廣安市產品質量檢驗所