比色法主要是利用了尿素與顯色劑的特殊反應產生一種化合物，這種化合物的顏色深淺與尿素的含量為正比。當前，研究和實踐當中已經發現的尿素顯色反應較多，但可真正用于檢測的只有兩類，一類是基于二乙酰一肟的反應，另一類是基于2-異亞硝基苯丙酮的反應。而且目前基于這兩類反應的試劑種類較多，不同試劑又多有不同的修飾、改進，所以反應出來的顏色也不盡相同，這會對檢測波長的選擇造成影響，同時還會影響到檢測的準確度、靈敏度。在實際的檢測過程當中，我們必須要對試劑進行系統性的研究、實驗，確定最適合當下發酵酒尿素檢測的反應種類和試劑種類。

酶法檢測主要涉及脲酶，即尿素酰胺水解酶，在各類豆類植物籽實及細菌中均廣泛的存在脲酶，其相對分子質量在120000Da到130000Da左右，其特點是能夠對尿素產生特異性水解作用，產生氨氣以及二氧化碳。大部分的脲酶最適pH值在偏堿性的范圍內或直接為中性，腸道乳酸菌體內的酸性脲酶較為特殊，其最適pH值在2到4之間。對于發酵酒的尿素檢測而言，酸性的脲酶是非常合適的，將其加入到發酵酒當中可以對尿素起到分解作用，并產生氨氣以及二氧化碳，其生產的氨氣和二氧化碳量，與尿素的含量存在直接的關系，所以我們可以以此來判斷發酵酒當中的尿素含量。

當前，已經有了基于氨氣測定的專門用于尿素檢測的試劑盒，且在發酵酒的尿素檢測中應用已經較為廣泛。其主要利用酸性脲酶來分解發酵酒當中的尿素，進而產生氨氣，氨氣和2-酮戊二酸及原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在谷氨酸脫氫酶作用下，生成酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷氨酸以及水。在340nm處對原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸進行吸光值檢測，由于原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的減少量與氨的減少量成正比，所以由此可以檢測出尿素含量。另外，基于二氧化碳測定也可以來進行尿素檢測，方法是把發酵酒的檢測樣品流動注射到酸性脲酶固體柱當中，然后利用氣體擴散裝置，對產生的二氧化碳進行分離，再透過膜擴散到溴百里酚藍溶液中，在617nm處對溶液的吸光度進行測定，以得出二氧化碳的含量，由于二氧化碳的含量和尿素的含量成正比，所以又由此可以得出發酵酒樣品當中的尿素含量。

在以往的工作當中，用高效液相色譜法來對發酵酒進行尿素檢測是不多見的，因為檢測器基本都是紫外檢測器，同時尿素最大吸收波長又在203nm，在這樣的波長條件下，會對檢測的靈敏度、準確性造成影響，實際的檢出限較高，在發酵酒的尿素檢測中并不適用。后來，有研究人員開發了離子對色譜結合熒光檢測器測定葡萄酒中的尿素，其原理是利用固定化脲酶分解尿素產生氨，氨與鄰苯二甲醛衍生化后生成產熒光化合物，經離子對色譜分離后可用熒光檢測器檢測。該方法靈敏度高，但樣品前處理繁瑣，需經過過濾、脫醇、離子交換、C18預柱除雜等步驟。隨后該方法又得到了優化，降低了檢出限，并縮短了檢測分析時間。另外，有研究人員在酸性條件下，將尿素與二乙酰一肟、安替比林和氯化鐵在120℃下反應，反應產物經凝膠柱分離后，在波長466nm處進行檢測，間接測定了尿素含量。

在最近的幾年來，又出現了新的高效液相色譜熒光檢測器方法來檢測發酵酒中的尿素含量，這種方法是在酸性條件下9-羥基噸與尿素反應可生成噸基脲，通過特定波長激發光對噸基脲進行照射之后，其便會發射出特定波長的發射光，由于此發射光的強度和尿素的含量為正比關系，所以我們可以通過對發射光強度的測定檢測尿素的含量。

袁曉紅 浙江省余姚市食品檢驗檢測中心