微孔板法測定乳粉中葉酸含量的 前處理方法優化
葉酸，是一類化學結構相似、生化特征相近的化合物統稱，由蝶啶、對氨基苯甲酸和一個或多個谷氨酸結合而成，是維生素B復合體之一[1]。它具有促進骨髓中幼細胞成熟，改善血管內皮功能、預防心血管疾病等作用，缺乏葉酸可能引起人體巨紅細胞性貧血以及白細胞減少癥[2-3]。葉酸是乳粉中重要的營養物質之一，為了保障乳粉的質量安全，開展乳粉中葉酸的檢驗方法研究顯得十分重要。
葉酸常用的檢測方法有比色法[4]、薄層層析法[5]、同位素放射免疫法[6]、色譜法[7]、微生物法等[8-9]。在我國的食品標準中，微生物法是檢測食品中葉酸含量的主要方法。尤其是在傳統的微生物法基礎上微量化和簡便化發展的微孔板法備受青睞[10]。但是由于乳粉的基質比較復雜，使用微孔板法進行葉酸檢驗時，前處理條件對實驗結果的影響顯著。本文通過考察微孔板法中提取溫度、提取時間和離心轉速等前處理條件對實驗結果的影響，尋找最優的前處理條件，以利于保證測定結果準確可靠。
儀器與試劑 儀器 電子天平(梅特勒PL2002)、酶標儀(Multiskan Mk3型)、生化培養箱(PHX-330H)、數顯恒溫水浴鍋(HH-4)、pH計(Mettler Toledo FE20)、臺式高速冷凍離心機(湘儀H1850R)。
試劑 包被有鼠李糖桿菌的微孔板、葉酸培養基、葉酸標準品、葉酸緩沖液、無菌水。以上試劑均來自VitaFast Folic Acid 定量檢測試劑盒
磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH7.2)：將7.8g磷酸二氫鈉(廣州化學試劑廠)加入1L去離子水中，調節pH至7.2，緩沖液需要當天制備。
實驗樣品 含定量葉酸的標準乳粉(中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心)，該乳粉標稱含量為：126.0 μg/100g。
實驗方法 標準曲線配制 以無菌水為稀釋液，按表1方法配置標準曲線溶液。 
注：標準曲線中已經包含樣品乳粉提取液在無菌離心管中加入離子水溶解的稀釋倍數(1:40)。
單因素試驗方法 提取溫度。準確稱取1.0000g± 0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。分別在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中提取30min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次(確保離心管密封)，快速冷卻至30℃以下。在10000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進一步稀釋。
提取時間。準確稱取1.0000g±0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。分別在100℃水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次(確保離心管密封)，快速冷卻至30℃以下。在10000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進一步稀釋。
離心轉速。準確稱取1.0000g±0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。在100℃水浴中提取30min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次(確保離心管密封)，然后快速冷卻至30℃以下。分別在4000r/min、6000r/min、8000r/min、10000r/min、12000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進一步稀釋。
檢測方法 在包被有鼠李糖桿菌的微孔板中加入葉酸培養基150μL，搖晃微孔板，使包被菌充分溶解在培養基中，再加入150μL標準曲線溶液或待測樣品，每樣3孔，作3次平行，用粘合箔蓋住微孔條，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性。37℃避光孵育48h。充分混勻培養物，使用酶標儀在波長為630nm下測量OD值。以3孔OD值的平均值為該樣品的OD值，代入標準曲線計算得出該樣品的葉酸含量。取3次平行的結果為該處理方法的最終結果。計算其與標示值的絕對差值?x，?x越小，表明結果越接近真值，該處理方式較合理。
結果與討論 標準曲線 以葉酸含量為橫坐標，OD值為縱坐標，采用4次多項式回歸的方法，得到標準曲線如圖1所示。相關系數R2=0.9981，線性關系良好。
提取時間 在沸水浴中以不同時間提取葉酸，然后經10000r/min離心處理后，所得葉酸結果如表4所示。實驗結果表明，隨著提取時間的延長，?x減小，在10min至30min間下降明顯，30min后，?x下降趨緩。說明在沸水浴，離心轉速10000r/min下，水浴處理30min以上即可獲得較理想的實驗效果。
離心轉速 在100℃下水浴30min后，以不同的離心轉速處理樣品液，所得葉酸結果如表5所示。實驗結果表明，隨著離心轉速的提高，?x減小，在4000r/min到10000r/min間降幅明顯，轉速超過10000r/min后，?x基本不變，說明離心轉速越高，越有利于葉酸的檢測。
從整體來看，無論采用哪種處理條件，用微孔板法測定乳粉中的葉酸含量，?x均為正數，即檢測結果偏高。其可能原因是微孔板法測定乳粉中葉酸含量的實質是比濁測定，利用的是葉酸作為鼠李糖桿菌生長的必需營養素，鼠李糖桿菌生長繁殖速度與葉酸含量成正相關，表現為體系的濁度與葉酸含量成正相關的關系[11]。乳粉溶液是一種復雜的膠體分散體系，無機鹽在水中以溶解狀態存在，蛋白質以膠體狀態懸浮在溶液中，脂肪形成乳濁液分散于乳中[12]。因此乳粉溶液本身存在較強的基質干擾。消除基質干擾的主要方法是沉淀體系中的大分子尤其是蛋白質等。溫度提高和離心速率的提高都有利于體系中乳蛋白的沉淀 [13]。此外，葉酸溶于熱水有一交換平衡過程，本實驗結果表明，40mL反應體積大約需時為30min，30min后該交換基本達到平衡。離心轉速的提高不僅可以進一步沉淀蛋白質等物質，還能使脂肪等成分上浮，脫離牛奶本體，使離心后的清液更接近于溶液，讓培養后的OD值更直觀地表現為微生物的生長情況。
前處理條件的控制對檢測乳粉中葉酸含量影響顯著。提取溫度、時間和離心轉速均對結果產生影響。其影響程度大致是離心轉速>提取時間>提取溫度。在沸水浴中，加熱30min，離心轉速為10000r/min的條件下處理，結果較理想。在該條件下，能在最大限度上減少基質干擾，使乳粉中葉酸測定結果更接近真值，提高了檢測結果的準確性。
廣州甘蔗糖業研究所
廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室
國家糖業質量監督檢驗中心
劉學文 高裕鋒 鄧倩南 陳海寧 林雅慧
余構彬 郭劍雄 李海喬
葉酸常用的檢測方法有比色法[4]、薄層層析法[5]、同位素放射免疫法[6]、色譜法[7]、微生物法等[8-9]。在我國的食品標準中，微生物法是檢測食品中葉酸含量的主要方法。尤其是在傳統的微生物法基礎上微量化和簡便化發展的微孔板法備受青睞[10]。但是由于乳粉的基質比較復雜，使用微孔板法進行葉酸檢驗時，前處理條件對實驗結果的影響顯著。本文通過考察微孔板法中提取溫度、提取時間和離心轉速等前處理條件對實驗結果的影響，尋找最優的前處理條件，以利于保證測定結果準確可靠。
儀器與試劑 儀器 電子天平(梅特勒PL2002)、酶標儀(Multiskan Mk3型)、生化培養箱(PHX-330H)、數顯恒溫水浴鍋(HH-4)、pH計(Mettler Toledo FE20)、臺式高速冷凍離心機(湘儀H1850R)。
試劑 包被有鼠李糖桿菌的微孔板、葉酸培養基、葉酸標準品、葉酸緩沖液、無菌水。以上試劑均來自VitaFast Folic Acid 定量檢測試劑盒
磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH7.2)：將7.8g磷酸二氫鈉(廣州化學試劑廠)加入1L去離子水中，調節pH至7.2，緩沖液需要當天制備。
實驗樣品 含定量葉酸的標準乳粉(中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心)，該乳粉標稱含量為：126.0 μg/100g。
實驗方法 標準曲線配制 以無菌水為稀釋液，按表1方法配置標準曲線溶液。
單因素試驗方法 提取溫度。準確稱取1.0000g± 0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。分別在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中提取30min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次(確保離心管密封)，快速冷卻至30℃以下。在10000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進一步稀釋。
提取時間。準確稱取1.0000g±0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。分別在100℃水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次(確保離心管密封)，快速冷卻至30℃以下。在10000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進一步稀釋。
離心轉速。準確稱取1.0000g±0.0005g樣品，將其加入50mL無菌離心管中，加入30mL磷酸鹽緩沖液，混勻，再用磷酸鹽緩沖液補至40mL。在100℃水浴中提取30min，前3min每1min混勻一次，后每5min混勻一次(確保離心管密封)，然后快速冷卻至30℃以下。分別在4000r/min、6000r/min、8000r/min、10000r/min、12000r/min下離心15min，然后在1.2mL無菌深孔板中對上清液進一步稀釋。
檢測方法 在包被有鼠李糖桿菌的微孔板中加入葉酸培養基150μL，搖晃微孔板，使包被菌充分溶解在培養基中，再加入150μL標準曲線溶液或待測樣品，每樣3孔，作3次平行，用粘合箔蓋住微孔條，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性。37℃避光孵育48h。充分混勻培養物，使用酶標儀在波長為630nm下測量OD值。以3孔OD值的平均值為該樣品的OD值，代入標準曲線計算得出該樣品的葉酸含量。取3次平行的結果為該處理方法的最終結果。計算其與標示值的絕對差值?x，?x越小，表明結果越接近真值，該處理方式較合理。
結果與討論 標準曲線 以葉酸含量為橫坐標，OD值為縱坐標，采用4次多項式回歸的方法，得到標準曲線如圖1所示。相關系數R2=0.9981，線性關系良好。
圖1 標準曲線
提取溫度 在不同溫度下提取葉酸30min，10000r/min離心處理后，所得葉酸結果如表3所示。從結果可以看出，隨著提取溫度的升高，?x也減小，水浴溫度達到沸水浴(100℃)時，?x最小，提示沸水浴可能是最適合的水浴條件。
前處理條件的控制對檢測乳粉中葉酸含量影響顯著。提取溫度、時間和離心轉速均對結果產生影響。其影響程度大致是離心轉速>提取時間>提取溫度。在沸水浴中，加熱30min，離心轉速為10000r/min的條件下處理，結果較理想。在該條件下，能在最大限度上減少基質干擾，使乳粉中葉酸測定結果更接近真值，提高了檢測結果的準確性。
廣州甘蔗糖業研究所
廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室
國家糖業質量監督檢驗中心
劉學文 高裕鋒 鄧倩南 陳海寧 林雅慧
余構彬 郭劍雄 李海喬
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