材料和方法

　　培養基 MRS(液體)、MRS(固體)、糖醇發酵培養基、蛋白胨水、明膠液化培養基、硝酸鹽還原培養基

　　試驗方法 乳酸菌的分離、鑒定:無菌操作條件下，稱取5g泡菜，碾碎，加入裝有玻璃珠的三角瓶中，再加入50mL滅菌生理鹽水，充分震蕩后用生理鹽水做10倍的梯度稀釋，取10-4和10-5稀釋度做平板涂布，置于37℃生化培養箱培養24h。選取表面光滑凸起，周邊整齊，直徑1.0～1.5mm的菌落，做革蘭氏染色，再對革蘭氏陽性桿狀無芽孢菌落，多次劃線培養直至得到純菌株。最后依據《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行生理生化實驗。

　　分子生物學鑒定:采用試劑盒提取上述菌株的DNA作為模板，進行16s rDNA 基因PCR克隆。PCR擴增引物為27F(5’-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，反應體系為25μL(10×buffer 2.5μL, 25 mmol/L MgCl2 1μL, 25 mmol/L dNTP 1μL, 27F和1492R(各20μmol/L)各0.5μL, DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，滅菌去離子水18.2μL)，反應程序為95℃ 5min;95℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 90s，35個循環。PCR產物經瓊脂糖電泳驗證后，測序由北京鼎國生物技術有限公司完成。

　　結果 乳酸菌的篩選、分離、鑒定:根據菌落的大小、透明程度、顏色、表面是否光滑、凸起等特征用MRS培養基從泡菜中篩選出15株陽性菌株，然后轉接于MRS固體培養基中，通過復篩，選出1株菌落呈圓形、直徑1.0-1.5mm，凸起、微白色、濕潤、邊緣整齊(圖1)，革蘭氏陽性無芽孢桿菌(圖2)，初步命名為W菌株。

　　圖1 W菌株菌落形態 圖2 W菌株的菌體形態

　　根據表1中生理生化試驗結果及《常見細菌系統鑒定手冊》初步鑒定該菌株屬于乳酸菌。

　　表1 生理生化試驗結果

　　檢測項目 結果 檢測項目 結果

　　蔗糖 + 木糖 +

　　乳糖 + 山梨酸鉀 +

　　麥芽糖 + 過氧化氫酶 —

　　甘露醇 + 明膠液化 —

　　海藻糖 + 吲哚試驗 —

　　葡萄糖 + 硝酸鹽還原酶試驗 —

　　山梨醇 + V—P試驗 —

　　注：+：試驗結果為陽性;-：實驗結果為陰性

　　分子生物學鑒定結果:對菌株進行16S rDNA基因克隆、測序，通過NCBI中使用BLAST軟件比對，將相似度高的序列用Mega軟件編輯，通過UPGMA計算法構建比對進化樹，綜合生理生化試驗結果，確定該菌株為植物乳桿菌(lactobacilus plantarum)。

　　圖3 W菌株與9株乳酸菌的16S rDNA同源性分析進化樹

　　本文從泡菜中篩選出一株革蘭氏陽性無芽孢桿菌，經過形態學觀察、生理生化鑒定及分子生物學鑒定，確定該菌株為植物乳桿菌。

　　吳云 江西省湖口縣市場和質量監督管理局